Kullanıcı Oyu: 0 / 5

Yıldız etkin değilYıldız etkin değilYıldız etkin değilYıldız etkin değilYıldız etkin değil
 

Ganoderma lucidum, Mikroglial Aktivasyonun Engellenmesiyle Dopaminerjik Nöron Dejenerasyonunu Korur

Ruiping Zhang, Shengli Xu, Yanning Cai, Ming Zhou, Xiaohong Zuo ve Piu Chan

Pekin Geriatri Enstitüsü ve Nörobiyoloji ve Nöroloji Anabilim Dalı, Eğitim Bakanlığı Nörodejeneratif Hastalıklar Kilit Laboratuvarı, Capital Medical University Xuanwu Hastanesi, 45 Changchun Caddesi, Pekin 100053, Çin

20 Ocak 2009'da alındı; Kabul Tarihi 28 Mayıs 2009

Telif Hakkı © 2011 Ruiping Zhang ve ark. Bu, Creative Commons Attribution License kapsamında dağıtılan ve orijinal çalışmanın doğru bir şekilde belirtilmesi koşuluyla, herhangi bir ortamda sınırsız kullanım, dağıtım ve çoğaltmaya izin veren açık erişimli bir makaledir.

Özet

Bol miktarda kanıt, nöroinflamasyonun Parkinson hastalığının (PD) patogenezine katılmasını önerdi. Ortaya çıkan kanıtlar, mikroglianın PD'de progresif nörodejenerasyonda kilit rol oynayabileceğini ve umut verici bir terapötik hedef olabileceğini destekledi. Geleneksel bir Çin şifalı bitki olan Ganoderma lucidum (GL), klinik çalışmalarımızda potansiyel anti-enflamatuar ve immüno modüle edici özelliklere sahip olabileceğini düşünmemizi sağlayacak potansiyel nevroprotektif etkiler gösterdi. Bu hipotezi test etmek için, dopaminerjik nöronlar ve mikroglia'nın birlikte-kültürlerini kullanarak, mikroglial aktivasyonu korumak yoluyla, GL'in potansiyel nöroprotektif etkisini ve olası altta yatan etki mekanizmasını araştırdık. Mikroglia, LPS ve MPP + ile işlemden geçirilmiş MES 23.5 hücre membranları tarafından aktive edilir. Bu esnada, GL ekstraktları doza bağımlı olarak mikroglia kaynaklı proenflamatuar ve sitotoksik faktörlerin (nitrik oksit, tümör nekroz faktör-α (TNF-α), interlukin 1β (IL-1β)] üretimini önemli ölçüde önlemekte ve TNF-α ve IL-1β ekspresyonlarını mRNA seviyesinde de etkiler. Sonuç olarak, sonuçlarımız, GL'nin anti-inflamasyon yoluyla PD'nin tedavisinde umut verici bir ajan olabileceğini desteklemektedir.

Parkinson hastalığı (PD) klinik olarak yavaş hareket, sertlik, dinlenme sarsıntısı ve denge bozuklukları ile karakterize, yaygın nörodejeneratif bir hastalıktır [1]. Hastalığın ilerlemesi ile birlikte, pek çok hasta anksiyete, depresyon, kabızlık ve bunama dahil olmak üzere motorlu olmayan semptomlar geliştirir. PD semptomlarını hafifleten ilaçlar olmasına rağmen, bu ilaçların kronik kullanımı PD'nin progresyonunu engellemek için etkili değildir ve zayıflatıcı yan etkilerle ilişkilendirilmiştir. Bu nedenle, dejeneratif progresyonu yavaşlatan veya durduran nöroprotektif tedavilerin geliştirilmesi büyük önem arz etmektedir [2]. Bununla birlikte, etkili nöroprotektif tedavilerin gelişimi, PD'nin patogenezi hakkındaki sınırlı bilgimiz tarafından engellenmektedir.

PD'de nöronal dejenerasyondan sorumlu etyoloji ve patogenez bilinmemektedir. Birkaç kanıt, glia aktivasyonunun ve inflamatuvar süreçlerin ilerleyici dejenerasyona yol açan olayların kaskadına karıştığını desteklemektedir [3, 4]. PD'li hastaların substantia irigranında dejeneratif nöronların yakınında çok sayıda aktive edilmiş mikroglia bulunmaktadır [5]. Olgun beyindeki mikroglia, tipik olarak, dağılmış morfoloji ile karakterize dinlenme halindedir ve beyin ortamını izler. Çevre toksinleri, nörotoksinler gibi mikroorganizmalar anormal uyarılara yanıt olarak aktive olur ve nitrik oksit (NO), tümör nekroz faktörü-α (tüpteki tümör nekroz faktör-α) gibi sitotoksik faktörlerin aşırı bir üretimiyle önemli ve oldukça zararlı nörotoksik etkilere yol açabilir TNF-α), interlökin 1β (IL-1β) ve süperoksit ve benzeri [3, 5-7].

Ganoderma lucidum (GL), 1000 yıldır Çin'de sağlığı geliştirmeye yönelik alternatif bir ilaç tedavisi olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Araştırmalar, GL ekstraktının bileşenlerinin immünomodülasyon, inflamasyonu baskılama, mitokondri enerji üretimini teşvik etme ve serbest radikalleri süpürme gibi geniş bir farmakolojik etki sergilediğini gösterdi [8-11]. Önceki çalışma, GL ekstraktlarının serebral iskemi sonrasında nöronal kaybı önleyebileceğini göstermektedir [12]. Ancak, GL'nin dopaminerjik nöron dejenerasyonuna karşı koruma sağlayıp sağlamayacağı ve mikroglial hücrelerin eksojen veya endojen uyarana karşı inflamatuar cevaplarını zayıflatıp azaltamayacağı bilinmemektedir. Bu soruları şu anki çalışmada cevaplamaya karar verdik.

2. Yöntemler

2.1. Malzemeler

GL özleri PuraPharm Corporation (Guangxi, Çin) tarafından çok sayıda: 070106 ile sağlandı. Özler, meyve organı metanol ve düşük sıcaklıkta ekstraksiyon teknolojisi ile hazırlandı. Ana bileşenler ağırlıklı olarak polisakarit triterpenler ve ergosterol içermektedir. Kullanılan GL özleri, bir polisakkarit ve ergosterin içeriği ile tanımlandı. Hesaplamaya göre, polisakarit verimi, Ganoderma meyvesi gövdesi açısından% 0.6 (a / a) ve ergosterol% 0.35 idi. GL, fosfat-tamponlu salin içinde çözülmüştür. Hücre kültür reaktifleri, Gibco (Grand Island, NY, ABD) ve [3H] dopaminden (DA) PerkinElmer Life Science'dan (Boston, MA, ABD) satın alındı. Lipopolysaccharides ve Griess reaktifleri Sigma'dan (St Louis, MO, ABD) satın alındı. Sıçan CD11b'ye (OX-42) karşı monoklonal antikor Serotec'den (Oxford, UK) elde edildi. Sırasıyla sırasıyla Dojindo (Kyushu, Japonya) ve IBL (Gunma, Japonya) 'dan süperoksit Assay Kiti-WST ve sıçan IL-1β ELISA kitleri elde edilirken diaclone (Besancon, Fransa) Rat TNF-α tespit ELISA kitleri sağladı. Gerçek zamanlı PCR reaktifleri Takara (Tokyo, Japonya) tarafından sağlanmıştır.

2.2. Microglia ve MES Kültürleri 23.5 Hücreler

Microglia izole edildi ve Laboratuvar Hayvan Merkezi tarafından sağlanan 12-24-yaş Wistar sıçanlarının beyinlerinden saflaştırıldı [13]. Araştırma, Birleşmiş Milletler Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından benimsenip ilan edilen Helsinki Deklarasyonu'na ve Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak yürütülmüştür. Tüm deney protokolleri Capital Medical University'nin İnsan ve Hayvan Konularının Değerlendirilmesi Komitesi tarafından onaylanmıştır. Kısaca, beyinler incelendikten ve menenjeler çıkarıldıktan sonra dokular kıyılmış ve tripsin (0.1 M fosfat tamponu içinde% 0.25 tripsin-EDTA) ile 37 ° C'de 20 dakika süreyle sindirilmiş, ateşle parlatılmış bir Pasteur pipeti ile toz haline getirilmiş ve filtrelenmiş bir 200-M naylon hücre süzgeçten geçirildi. 121 g'da 5 dakika süreyle santrifüj edildikten sonra doku,% 10 sığır fetüsü serumu (FBS) içeren DMEM içine asıldı ve şişe başına 5 x 105 hücre / ml'lik bir yoğunlukta 75 cm2'lik şişelere ekildi. Ekimden iki hafta sonra şişeler 180 rpm'de 4 saat çalkalandı ve yüzen hücreler toplandı ve 800 rpm'de 5 dakika santrifüje tabi tutuldu, hücreler tekrar süspansiyon haline getirildi ve daha deneysel işlem için 96 oyuklu plakalara plak edildi.

Dopaminerjik hücre hattı MES 23.5, Houston, Baylor Tıp Koleji Nöroloji Bölümü Prof. Wei-dong Le'den hediye edildi. MES 23.5 hücreleri, sıçan embriyonik mesencefalik hücrelerinin sıçangil N18TG2 nöroblastoma hücreleri ile somatik hücre füzyonundan türetilmiştir [14]. MES 23.5 hücreleri, SN zona compacta'nın gelişmekte olan nöronlarının pek çok refahını sergilemekte ve birincil kültürlerden daha fazla homojenlik ve serbest radikal aracılı sitotoksite ve kalsiyum bağımlı hücre ölümlülüğüne duyarlılık gibi bu tür ilk çalışmalar için birçok avantaj sunmaktadır. MES 23.5 hücreleri, 104 hücre / cm2'lik bir yoğunlukta polilisin ile önceden kaplanmış 24 delikli plakalara ekildi ve% 95 hava /% 5 CO2 nemlendirilmiş atmosfer inkübatöründe 37 ° C'de Sato bileşenleri ile DMEM'de tutuldu. Kültürlenmiş MES 23.5 hücrelerinin bazıları mikroglia ile birlikte kültürlenmiştir.

Reaktif mikroglia ile MES 23.5 hücreleri arasındaki etkileşimi incelemek amacıyla 24 oyuklu kültür plakalarında mikroglia ve MES 23.5 hücreleri birlikte kültürlenmiştir. Kısaca, saflaştırılmış mikrogram 2: 1 oranında (MES 23.5 ila mikroglia) MES 23.5 hücrelerinin eklenmesinden 1 gün önce 1 x 104 / oyuk yoğunluğunda kaplanmıştır. Eş-kültürler,% 2 ısı ile inaktif FBS içeren Sato kıvamlandırılmış ortamında muhafaza edildi. Mikroglia veya MES 23.5 hücrelerinin kültürleri tek başına veya birlikte, pozitif kontrol, GL ekstraktları (50-400 g / ml) veya MES 23.5 hücre membranı bileşenleri (150 g / ml) olarak lipopolisakarit (LPS, 0.25 g / ml) ile 24 saat süreyle muamele edildi. / ml) [13].

2.3. İmmünositokimya

Paraformaldehitle sabitlenmiş hücre kültürleri daha önce tarif edildiği gibi immüno-lekelendi [15]. Microglia, bir monoklonal antikor OX-42 ile lekelenmiştir. Kısaca, hücre kültürleri,% 3 H202 ile 15 dakika süreyle muamele edildi, daha sonra uygun normal serum ile bloke edildi ve ardından antikor seyrelticilerinde seyreltilmiş birincil bir antikor ile gece boyunca 4 ° C'de inkübe edildi [15]. Uygun biyotinlenmiş bir sekonder antikor ve daha sonra ABC reaktifleri ile inkübasyondan sonra bağlanmış kompleks 3,3'-diaminobenzidin (DAB) ile renk gelişimi ile görselleştirildi. Görüntüler Nikon ters mikroskop ile kaydedildi.

2.4. MES 23.5 Hücre Membran Fraksiyonunun Hazırlanması

24 saat süreyle MPP + 10 M'ye maruz kaldıktan sonra, MES 23.5 hücreleri, 0.25-M sükroz, 100 mM PBS, 1 mM MgCl2, 1 mM EDTA ve 2-μM proteaz inhibitörü PMSF içeren bir tampon içinde hasat edildi ve bir cam-teflon homojenleştirici [13]. Daha sonra homojenat, ham nükleer fraksiyonları uzaklaştırmak için 4 ° C'de 10 dakika süreyle 8000 g'de santrifüje tabi tutuldu. Süpernatanlar tekrar 100 000 g'de 60 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüje tabi tutuldu. Çökeltiler homojenleştirildi ve kültür ortamı içinde süspanse edildi ve nöronal zar fraksiyonları olarak kullanıldı.

2.5. Yüksek Affinity [3H] DA Alım Testi

Her kuyucuktaki hücreler 1 ml Krebs-Ringer tamponu (16 mM NaH2P04, 16 mM Na2HP04, 119 mM NaCl, 4.7 mM KC1, 1.8 mM CaCI2, 1.2 mM MgS04, 1.3 mM EDTA ve 5.6 mM glukoz; pH 7.4). Hücreler daha sonra 30 dakika boyunca 37 ° C'de Krebs-Ringer tamponu (10 l / oyuk) içinde 10-nM [3H] DA ile inkübe edildi [15]. Dopamine ait spesifik olmayan alım, dopamin ve 1 mM nomifensini (10 ul / oyuk) alan paralel kuyularda, nöronal yüksek afiniteli dopamin alımının bir inhibitörü olarak belirlendi. Daha sonra, hücreler buzla soğutulmuş Krebs-Ringer tamponu (1 ml / oyuk) ile üç kez yıkandı ve 1 N NaOH (0.5 ml / oyuk) ile yıkandı. Lizatı gece boyunca 3 ml sintilasyon sıvısı ile karıştırdıktan sonra, Perkin Elmer 1450LSC Lüminesans Sayacı (Waltham, ABD) ile radyoaktivite belirlendi. Spesifik alım miktarı, toplam aktivite için spesifik olmayan sayımların çıkarılmasıyla tespit edildi.

2.6. Tahlil Yok

NO üretimi, salınan NO metabolitlerini (nitratlar ve nitritler) Griess reaktifi ile ölçerek nicelendirildi [16]. LPS / hücre fraksiyonuna 24 saat maruz bırakıldıktan sonra, kültür ortamı numuneleri toplandı ve santrifüjleme yoluyla hücre içermeyen hazırlandı. Ortam, uygun standartlara sahip bir LP-400 ELISA okuyucuda (Diagnostics Pasteur, Marne-la-Coquette, Fransa) 540 nm'de absorbans ölçülmeden önce oda sıcaklığında 10 dakika boyunca aynı hacimdeki Griess reaktifiyle inkübe edildi.

2.7. TNF-α, IL-1β ve Süperoksit Deneyi

Numuneler, NO numunelerine benzer şekilde hazırlandı ve bu faktörlerin üretimi, üreticinin talimatlarına göre sıçan TNF-a kiti, sıçan IL-1β ELISA kiti ve süperoksit Analiz Kiti-WST kullanılarak belirlendi. Ardından plaka okuyucuyu çalıştırın ve 450 nm'de ölçüm yapın.

2.8. RNA İzolasyonu ve Gerçek Zamanlı PCR

Toplam RNA, primer mikroglial hücrelerden RNAprep Kit kullanılarak üreticinin spesifikasyonlarına göre ekstrakte edildi. RNA, rastgele 9-mer'lerle hazırlanmış ve üreticinin önerdiği protokolü izleyerek AMV ters transkriptaz kullanarak ters transkripsiyon (RT) ile cDNA'ya dönüştürülmüştür [17, 18]. Nihai cDNA'ya, daha sonra, 1 x SYBR Green (Molecular Probes) nihai konsantrasyonu ve 20 μl reaksiyonda 0.2 M ilgi konusu primer seti içeren SYBR Premix Ex Taq ile gerçek zamanlı PCR uygulanmıştır. PCR karışımı, DNA motor Opticon 2'de (MJ araştırması, Waltham, MA) çalıştırıldı. Başlangıçta 10 saniye 95 ° C denatürasyon basamağından sonra reaksiyon, 95 ° C'de 5 saniye, 60 ° C'de 30 saniye ve 80 ° C'de 1 saniye boyunca 35 döngüden geçirildi. Erime eğrisi analizi, reaksiyon sonucunda elde edilen ürünlerin eşdeğer ve uygun ergime sıcaklıklarına sahip olmasını sağlamak için gerçekleştirildi. Kullanılan spesifik primerler Tablo 1'de listelenmiştir [17]. Hedef transkriptlerin nicelendirilmesi bir kalibrasyon eğrisine dayanıyordu. "Evde bakım" gen β-aktin, bir iç kontrol geni için hedeflenmiştir. Test geni verileri, karşılık gelen β-aktin verileri ile normalize edildi.

2.9. İstatistiksel analiz

Veriler, ortalama ± SD olarak ifade edildi. İstatistiksel önem, bir varyans analizi (ANOVA), ardından SPSS 11.5 kullanılarak LSD post hoc testi ile değerlendirildi. Bir değer istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

3. Sonuçlar

3.1. LPS ve MPP + ile Tedavi Edilen Dopaminerjik Hücre Membranları Tarafından İndüklenen Mikroglial Aktivasyon

Nörodejenerasyonda mikroglia aktivasyonu modelleri oluşturmak için, LPS ve MPP + ile muamele edilmiş dopaminerjik hücre membranları, mikroglia kültüründe veya dopaminerjik nöronda (MES 23.5 hücre hattı) ve mikroglia birlikte kültürlerde uyarı olarak kullanıldı. Microglia hücreleri, monoklonal antikor OX-42 kullanılarak CR3 tamamlayıcı reseptörü için boyama yoluyla görselleştirildi. Mikroglia kültürlerinin saflığı ~% 95'tir. Sessiz mikroglia, dallanmış biçimler veya iki kutuplu veya çok kutuplu süreçler gösterdi (Şekil 1 (a) ve 1 (b)) [19, 20]. Aktive mikroglia amoeboid morfolojiyi gösterdi (Şekil 1 (c) ve 1 (d)).

                                                                    şekil 1a                                                                                                                                      şekil 1b

                                                       şekil 1c                                                                                                                                              şekil 1d

Şekil 1: OX-42 ile işaretlenmiş sıçan mikroglia hücrelerinin morfolojisi. Sıçan mikrogliası araç ile (a) 100x; (b) 400x), LPS 0.25 g / ml ((c) 100x; (d) 400x) ile 24 saat inkübe edildi. Mikroglia, LPS ile muamele edildikten sonra amoeboid morfolojiye dönüşmüştür. Ölçek çubuğu 100 m'yi temsil eder.

Çok sayıda nörotoksik faktör arasından, NO, TNF-α, IL-1β ve süperoksit, mikroglial aktivasyonun yol açtığı dopaminerjik nörodejenerasyonun ana aracıları olabilir. İlk olarak, LPS'nin neden olduğu mikroglial aktivasyonu, mikroglial aktivasyonu yansıtan iyi belgelenmiş iki sitokin TNF-α ve IL-1β düzeylerini ve aktive mikrogliadan salınan çeşitli reaktif oksijen türlerini (ROS, NO ve süperoksit) düzeylerini ölçerek karakterize ettik . Uyarılmamış mikrogram, göz ardı edilebilir olan çok düşük miktarda herhangi bir sitokin üretir. LPS'ye (0.25 g / ml) maruz bırakıldıktan sonra TNF-α ve IL-1β düzeyleri 6-11 kat artmış ve NO ve süperoksit seviyeleri mikroglia kültüründe 5-11 kat artmıştır Medya (Şekil 2). MES 23.5 hücreleri sadece MPP + tedavisinden sonra mikroglia aktive ettiğinden [19], MPP + ile tedavi edilen MES 23.5 hücre zar fraksiyonlarının (CF) aktivasyon etkilerini inceledik. MPP + ile işlemden geçirilmiş hücre zar fraksiyonu (150 g / ml), TNF-α ve IL-1β üretimi ile inkübasyon, 4-10 misli kat artmıştır (Şekil 2). MPP + membran fraksiyonu ile muamele edilmiş mikroglial kültür ortamından NO ve süperoksidin seviyeleri 2-10 misli arttı (Şekil 2). MPP + içermeyen veya GL ile muamele edilen ham membran MPP + membran fraksiyonuna kıyasla yalnızca en az aktive edici etkiye sahiptir (veriler sunulmamıştır).

Şekil 2: LPS ve CF, mikroglianın aktive edilmesi yoluyla sitokinleri arttırır. Mikroglial aktivasyon, LPS'ye (0.25 g / ml) ve CF'ye (150 g / ml) maruz bırakıldıktan sonra hücrelerdeki TNF-α, IL-1β, NO ve süperoksidin düzeylerini ölçmek suretiyle tespit edildi. Araç kontrollerinde TNF-α, IL-1β, NO ve süperoksit seviyeleri sırasıyla 106.55 pg / ml, 119.09 pg / ml, 0.6 M ve 5.22 U / ml'dir. Seviyeler, kontrol konsantrasyonlarına kıyasla kat artışı ifade etmiştir. Tüm sitokinler önemli ölçüde arttırıldı (*).

3.2. GL, Proliferatif Faktörlerin ve Mikrogliada Tanıtan ROS'un Üretimini Engelliyor

Microglia, aktivasyonun bir sonucu olarak sitokin üretebilir [21-23]. GL'in nöroprotektif aktivitesinin altta yatan mekanizmasını aydınlatmak için, GL'nin mikrogliadan türetilen inflamatuar sitokinler ve ROS seviyelerine etkisini araştırdık. Mikroglial hücre kültürleri 30 dakika boyunca farklı dozlarda (50-400 g / ml) GL ile ön işleme tabi tutuldu ve ardından MPP + ile işleme tabi tutulmuş LPS veya CF maruz bırakıldı. Şekil 3 ve 4'te gösterildiği gibi düşük dozda (50 g / ml) GL düşük inhibisyon etkileri gösterirken, daha yüksek GL (100-400 g / ml) ile ön tedavi, LPS'den kaynaklanan NO ve SOD artışını şiddetle azaltırken veya CF konsantrasyona bağlı bir modadır. Daha yüksek 400 g / ml dozu neredeyse NO üretimini tamamen önledi. Eşdeğer konsantrasyonda, GL, MPP + ile tedavi edilen LPS ve CF'den sonra TNF-α ve IL-1β salınımını önemli ölçüde azalttı (Şekil 5).

Şekil 3: GL, doza bağımlı olarak NO'nun LPS veya CF'ye bağlı olarak üretilen üretimine karşı korur. Kültürler 0.25 g / ml LPS veya 150 g / ml CF ile maruz bırakılmadan 30 dakika önce belirtilen konsantrasyonda GL ile muamele edildi. Kültür süpernatantları toplandı ve NO için denendi. Veriler, kontrol grubunun kat artışı olarak ifade edildi ve üçlü halinde gerçekleştirilen iki deneyin ortalama ± SD ortalaması olarak sunuldu. * LPS sadece muamele edilmiş kültürlerle ve ** CF ile muamele edilmiş kültürlerle karşılaştırıldığında ** karşılaştırılmıştır.

Şekil 4: GL, doza bağımlı bir tarzda LPS veya CF ile uyarılan süperoksit üretimine karşı korur. Kültürler 0.25 g / ml LPS veya 150 g / ml CF ile maruz bırakılmadan 30 dakika önce belirtilen konsantrasyonda GL ile muamele edildi. Süperoksit üretimi SOD test kiti-WST ile ölçülmüştür. Veriler, kontrol grubunun kat artışı olarak ifade edildi ve üçlü halinde gerçekleştirilen iki deneyin ortalama ± SD ortalaması olarak sunuldu. * LPS sadece muamele edilmiş kültürlerle ve ** CF ile muamele edilmiş kültürlerle karşılaştırıldığında ** karşılaştırılmıştır.

 

Şekil 5: GL, LPS veya CF'nin TNF-a (a) ve IL-1β (b) 'nin indüklediği doza bağımlı bir şekilde üretimine karşı korur. Kültürler 0.25 g / ml LPS veya 150 g / ml CF ile maruz bırakılmadan 30 dakika önce belirtilen konsantrasyonda GL ile muamele edildi. TNF-α ve IL-1β seviyeleri Yöntemler bölümünde tarif edildiği gibi belirlendi. Veriler, üçlü olarak gerçekleştirilen iki deneyin ortalama ± SD'si olarak ifade edilmiştir. * ve ** TNF-α için LPS ve CF ile işlem görmüş kültürler ile karşılaştırılmıştır. sırasıyla IL-1β için LPS ve CF sadece muamele edilmiş kültürler ile karşılaştırılmıştır.

 

 

3.3. GL, Microglia varlığında ve yokluğunda MPP + ile indüklenen Dopaminerjik Nörodejenerasyona karşı korur

İnflamasyondan kaynaklanan nörotoksisiyi değerlendirmek için, dopaminerjik MES 23.5 nöronları 24 saat microglia ortak kültürü yokluğunda veya varlığında 100 M MPP + veya 0.25 g / ml LPS'ye maruz bırakıldı ve nörotoksisite [3H] DA alım testi kullanılarak değerlendirildi. MPP + 'ye maruz kalma, tek başına MES 23.5 nöronları için [3H] DA alımında yaklaşık% 66 oranında önemli bir azalmaya neden olurken, MES 23.5 ve mikroglia birlikte kültürleri için yaklaşık% 74 düşüş kaydedildi (Şekil 6). 400 g / ml GL ile ön-muamele, mikro-çiçek ko-kültürlerinin varlığında ve yokluğunda MPP + ile indükte edilen [3H] DA tutulumundaki azalmayı sırasıyla% 35 ve% 38 oranında önemli derecede korudu.

Şekil 6: GL, mikrogramlı veya mikrogramsız MES 23.5 hücre kültürlerinde [3H] DA alımının MPP + ile indüklenen azalmasına karşı korur. Kültürler, araç veya 100 M MPP + ve 400 g / ml GL ile muamele edildi. GL, MPP + maruziyetinden 30 dakika önce verildi. [3H] DA'nın alımı, Yöntemler bölümünde tarif edildiği gibi değerlendirildi. Veriler, çoğaltılmış deneylerde hücre numunelerinden üretildi ve araç grubunun yüzdesi olarak ifade edildi. * MPP + 'ya maruz bırakılmadan mikroglia kültürlerinin yokluğunda veya varlığında ilgili MES 23.5 ile karşılaştırıldığında; ** mikrogliasız MPP + ile tedavi edilen MES 23.5 kültürleri ile karşılaştırıldığında; # GL'ye maruz kalmadan mikroglia kültürlerinin yokluğunda veya varlığında ilgili MES23.5 ile karşılaştırıldığında.

3.4. GL, Microglia'da LPS ile Oluşan Dopaminerjik Dejenerasyona Karşı Korur

Nöron-mikroglia birlikte kültürleri, 24 saat süreyle 0.25 g / ml LPS'ye maruz bırakıldığında, [3H] DA alımları, birlikte kültürlere kıyasla yaklaşık% 50 azaldı (Şekil 7). Eş-kültürlerin 400 g / ml GL ile ön işleme tabi tutulması, aynı zamanda, [3H] DA alımında LPS'nin indüklediği azalmayı belirgin olarak zayıflatmıştır (GL ile% 22 kaybı, GL olmayan% 50 kaybı).

Şekil 7: GL, mikrogramlı ya da mikro gramlı olmayan MES 23.5 hücre kültürlerinde LPS ile indüklenen [3H] DA alımını azaltmaya karşı korur. Kültürler, araç veya 0.25 g / ml LPS ve 400 g / ml GL ile muamele edildi. LPS maruziyetinden 30 dakika önce GL'ye verildi. [3H] DA'nın alımı, Yöntemler bölümünde tarif edildiği gibi değerlendirildi. Veriler, çoğaltılmış deneylerde hücre numunelerinden üretildi ve araç grubunun yüzdesi olarak ifade edildi. * LPS'ye maruz bırakılmadan mikroglia kültürlerinin yokluğunda veya varlığında ilgili MES 23.5 ile karşılaştırıldığında; # karşılık gelen MES 23.5 ve GL ile temas ettirilmemiş mikroglia birlikte kültürleri ile karşılaştırıldığında.

3.5. GL, LPS ve MPP + ile İşlem Görmüş Membran ile TNF-α ve IL-1β mRNA'sının Artmış Ekspresyonunu Engelliyor

Bütün bu proenflamatuar faktörlerin sentezi çeşitli seviyelerde kontrol edilir. Transkripsiyon sonrası, translasyonel ve post-translasyonel mekanizmalar önemli rol oynarken, gen transkripsiyonu birincil düzenleyici bölge gibi gözükmektedir. TNF-α ve IL-1β mRNA ekspresyon seviyeleri, kontrol hücrelerinde zar zor tespit edilebilirdi ancak LPS ve CF ile önemli ölçüde artmıştı. 100-400 g / ml GL ön tedavisi, doza bağımlı bir şekilde ekspresyonunu inhibe etmiştir. Daha yüksek 400 g / ml GL dozu,% 90 koruma sağlamıştır (Şekil 8).

 

Şekil 8: GL, TNF-α (a) ve IL-1β'nın (b) mRNA düzeylerinin LPS veya CF ile uyarılan aşırı ekspresyona karşı doza bağımlı bir biçimde korur. Kültürler 0.25 g / ml LPS veya 150 g / ml CF ile maruz bırakılmadan 30 dakika önce belirtilen konsantrasyonda GL ile muamele edildi. Toplam RNA çıkarıldı ve daha sonra Yöntemler bölümünde tarif edildiği gibi gerçek zamanlı PCR'ye tabi tutuldu. Veriler, ortalama eşik çevrim değerlerinden hesaplanan ve ortalama ± SD olarak sunulan kontrol grubunun yüzdesi olarak ifade edilir (sırasıyla LPS veya CF ile tedavi edilen grup). Farklı kültür takımlarından bağımsız RNA müstahzarları hazırlandı ve deney setinin RNA numunelerinden üç kopya tayin edildi. * Sırasıyla LPS veya CF ile işlem görmüş kültürler ile karşılaştırılmıştır.

4. Tartışma

Bu çalışmada, GL'nin dopaminerjik nöronları, MPP + ve LPS'ye maruz bırakıldıktan sonra mikroglial aktivasyon ile indüklenen enflamatuar hasara karşı etkili bir şekilde koruduğunu gösterdik. Altta yatan mekanizma, GL'nin mikrogramdan türeyen toksik faktörlerin (NO, TNF-α, IL-1β ve süperoksit) üretimine karşı koruma kabiliyeti ile ilişkili görünmektedir. Bu GL'nin TNF-α ve IL-1β'nın mRNA ekspresyonunu belirgin şekilde aşağı regüle ettiği gözlemi ile desteklenmektedir.

Patolojik olarak patolojik olarak ilerleyen nigral hücre dejenerasyonu ile karakterize olan mikroglial aktivasyona eşlik eder. Çevresel veya endojen toksinlerin nöronal ölümle sonuçlanabileceği ileri sürülse de, mikroglia aktivasyonunun altında yatan mekanizma bilinmemektedir. LPS ve nörotoksinlerin mikroglia'yı aktive edebileceği ve proinflamatuvar faktörlerin ekspresyonunu inhibe ederek önleyebildiği progresif nörodejenerasyona neden olduğu gösterilmiştir [24]. Kanıtların artması kronik inflamasyonu PD de dahil nörodejeneratif hastalıklarla ilişkilendirmiştir.

Merkezi sinir sisteminin yerleşik doğal immün hücreleri olan Microglia, nöroinflamatuar süreçte önemli rol oynamaktadır. Microglia aktive edilebilir ve iki mekanizma yoluyla nörotoksite neden olabilir [20]. İlk olarak, mikroglia, LPS ve diğer toksinler gibi ateşli tetiği tanımak suretiyle nöron hasarını başlatabilir, [24] aktive olur ve nörotoksik proenflamatuar faktörler ve sitokinler üretir. Sonuç olarak, bu faktörler DA nöronlarının antioksidanını tüketebilir, mitokondriyal fonksiyonu bozabilir, glutamatın yeniden alımını inhibe edebilir [25] ve CNS doku hasarını başlatabilir [26]. Buna ek olarak, TNF-α gibi sitokinler, diğer istirahat mikroglialarını aktive ederek, aşırı oksitleyici peroksinitrit türleri oluşturmak için ROS, NO ve süperoksit köklerinin kendiliğinden etkilenmesine yol açan inflamatuvar cevabı güçlendirir [6, 27]. SN'de TNF'ye bağlı mikroglia aktivasyonu, NADPH oksidazın aktivasyonu yoluyla oksidatif stres ortamı oluşturur [28]. IL-1β'nın, lökositlerin MSS'ye infiltrasyonunu kolaylaştıran kan-beyin bariyerinin bozulması yoluyla CNS enflamasyonunun gelişmesinde rol aldığı gösterilmiştir [23,24]. NO, zar geçirgen olduğundan aşırı NO birikimi süperoksitle reaksiyona girerek, proteinlere, lipitlere ve DNA'ya saldırma ve değiştirme yeteneğine sahip olduğu gibi antioksidan savunmalarını da tüketen peroksinitrit oluşturabilir [25,26]. Mikroglial türevli ROS'un süperoksit gibi birçoğu, hücresel zarları verimli bir şekilde geçemez; bu hücre dışı ROS'un dopaminerjik nöronları aşmasına ve sinir içi içi toksik olayların tetiklenmesine neden olmaz; bununla birlikte süperoksit, hücre dışı boşlukta NO ile hızla tepki verebilir komşu nöronlarda hücre zarlarını kolayca geçebilen ve hücre içi bileşenlere zarar verebilen daha kararlı bir oksidan [27]. Bütün bu faktörler, pro-apoptotik genleri nöronal ölümle sonuçlandıracak şekilde düzenleyebilen bir anahtar transkripsiyon faktörünü, NF-κB'yi aktive edebilir [29, 30]. İkincisi, mikroglia, nöron hasarına tepki olarak aşırı aktif hale gelebilir ve bu da, komşu nöronlar için toksiktir [31, 32], nöron ölümünün devam eden döngüsüyle sonuçlanır. Çeşitli çalışmalar, hasar gören DA nöronlarının mikroglia'yı aktive ettiği ve PD'de nöronal dejenerasyona karıştığı gösterilen matris metalloproteinaz 3 (MMP3) [33], α-synuclein [34] ve nöromelanini [33, 35] serbest bıraktıklarını ortaya koymaktadır. Tüm bu olaylar ilerleyici nöron dejenerasyonuna yol açan kısır bir daire oluşturur (Şekil 9).

Şekil 9: Mikroglial aktivasyon ve nöron ölümü arasındaki moleküler mekanizmalar. Microglia, LPS ve diğer toksinler gibi enflamatuar tetikleyiciler tarafından aktive edilebilir ve dolayısıyla bir taraftan ROS, NO ve süperoksit radikallerinin aşırı oksitleyici peroksinitrit türleri oluşturmak için otomatik implikasyona neden olabilecek ve aynı zamanda diğer dinlenme mikroglialarını aktive eden proinflamatuar faktörler ve sitokinler üretebilir. SN'de TNF'ye bağlı mikroglia aktivasyonu, NADPH oksidazın aktivasyonu yoluyla oksidatif stres ortamı oluşturur. IL-1β, kan beyin bariyerini bozabilir ve merkezi sinir hücrelerine lökositler infiltrasyonunu kolaylaştırabilir. Bütün bu faktörler, pro-apoptotik genlerin nöronal ölümle sonuçlanmasına neden olan NF-κB'yi aktive edebilir. Bu olaylar, ilerici nöronal dejenerasyona yol açan kısır bir daire oluşturur. GL, anti-inflamatuar etki yoluyla mikroglia kaynaklı toksik faktörlerin üretimini inhibe edebilir.

Sıçan mesencefalonundan türetilen primer nöron-zenginleştirilmiş veya nöron-glia ko-kültürlerinde, rotenon ile uyarılan dopaminerjik nörodejenerasyon, mikroglial hücrelerin varlığına bağlıydı. Bu, aktive mikroglia'dan süperoksit üretimi ile sağlandı [15]. Sıçan beyinlerinin üst nigral alanındaki LPS enjeksiyonu, mikroglial ve astroglial çoğalma ile sonuçlandı ve bu reaktif glial hücreler, sonraki nöronal ölümün önemli mediatörleriydi [36]. Dahası, fare beyninde glial hücre aktivasyonunun inhibe edilmesi, iNOS ve IL-1 oluşumunu bloke ederek MPTP kaynaklı nörotoksisiteyi azalttı [37]. Mevcut çalışmanın sonuçları, mikroglia kaynaklı toksik faktörlerin üretiminin inhibisyonunun GL'nin anti-inflamatuar etkisinin altında yatan bir mekanizma olabileceğini düşündürmektedir. Mikroglial aktivasyon ve nöronal hasarla ilgili varsayılan mekanizmalar Şekil 9'da gösterilmektedir.

GL, 100 AD'den beri Çin'de kullanılan doğal bir bitkisel tıbbi mantar. Klinik olarak GL, kolesterolü düşürmek, hafızayı geliştirmek ve yaşlanmayı önleme amacıyla kullanılmıştır. Deneysel olarak, GL ekstraktlarının nöro-koruyucu etkileri olduğu kadar immün modüle edici, anti-enflamatuar, anti-oksidatif hasar ve antitümör aktivitelere sahip olduğu gösterilmiştir [8, 10, 38]. GL tedavisi, fitohemaglutinin, CD3, CD4, CD8 ve CD56 lenfositlerinin sayıları, interlökin (IL) -2, IL-6 ve interferon (IFN) -γ plazma konsantrasyonları ve NK aktivitesine karşı mitojenik reaktiviteyi arttırma eğilimi gösterirken, plazma konsantrasyonları Kanser hastalarında IL-1 ve TNF-α'nın azaldığı gösterilmiştir [39]. Çalışmalar aynı zamanda günde bir kez 15 günlük GL uygulamasının yaşlı sıçanlarda Krebs siklüs dehidrogenazlarını ve mitokondriyal elektron taşıma zincir kompleksi IV aktivitelerini arttırmada önemli derecede etkili olduğunu göstermiştir. Ekstraktın derin faaliyeti GL'nin önemli antioksidan özelliğiyle ilişkilendirilebilir [40].

GL'nin en önemli farmakolojik olarak aktif bileşenleri polisakaritler ve triterpenoidlerdir. Polisakaritler, özellikle β-D-glukanların, bağışıklık modülasyonu ve anti-anjiyogenez yoluyla anti-tümör etkilerine sahip olduğu bilinmektedir. Buna ek olarak, polisakkaritler serbest radikallere karşı koruyucu bir etkiye sahiptir ve mutajenlerin neden olduğu hücre hasarını azaltmaktadır. Triterpenoidlerin antioksidanasyon, hepatoprotektif, antihipertansif, hipokolesterolemik ve anti histaminik etkilere sahip olduğu bildirilmiştir [41]. Bununla birlikte, mevcut çalışmada rol alan aktif bileşenlerin daha fazla incelenmesi gerekmektedir.

PD için geçerli en etkili semptomatik tedavi levodopa uygulamasıdır, ancak hastalık ilerledikçe etkinlik azalmaktadır. Nigral DA nöronlarını ilerleyici ölümden kurtarmak için nöroprotektif stratejilerin şu anki odağı. Yeşil çay polifenolleri [42], ginsenosid [43], ginkgo biloba [44] ve polisakaridlerin DA nöronlarının dejenerasyonuna karşı koruma ve semptomları önleme potansiyeline sahip olduklarını gösteren kanıtlar artmaktadır [45] . Ek olarak, çalışmalar Çin otları veya bitkisel ekstraktların nöronal sağkalımı ve nevrit büyümesini teşvik edebileceğini ve antioksidanlar, DA taşıyıcı inhibitörü, monoamin oksidaz inhibitörü, serbest radikal süpürücü, zararlı şelatörleri gibi yeteneklerinden ötürü beyin hasarlarının işlevsel olarak iyileşmesini kolaylaştırdığını ileri sürmüştür. metal iyonları, hücre sağkalım genleri ve sinyal verme, anti-apoptoz aktivitesi ve hatta beyin kan dolaşımının iyileştirilmesi [46]. PD'ye karşı yeni farmasötik stratejiler, Çin otları ve bitki özlerinin biyolojik etkilerine katkıda bulunan çeşitli aktif varlıkları ve değerli kombinasyonları anlamak suretiyle keşfedilecektir.

Sonuç olarak, mikroglial aktivasyonu inhibe edebilen GL en motorik semptomların hafifletildiği DA replasmanı ve adjuvan cerrahi tedavi gibi güncel terapilerin aksine, PD'de nörodejenerasyon ve / veya fonksiyonu önleyebilir. Sınırlı envanter etkili ilaçlar ışığında, PD tedavisi için potansiyel bir ilaç olarak GL ile ilgili daha ileri çalışmalara gerek duyulmaktadır. Bu çalışmaların yakın gelecekte daha iyi tedavilerin ortaya çıkacağını düşünüyoruz.